Un equipo científico alemán ha desarrollado, por primera vez, modelos de ratones con un gen humano defectuoso responsable de una rara enfermedad genética: la hiperplasia suprarrenal congénita (HSC). El hallazgo, presentado en el XXV Congreso Europeo de Endocrinología que se está celebrando en Estambul, Turquía, puede ayudar a desarrollar nuevas terapias para personas con el tipo más común de esta patología congénita.

La HSC constituye un grupo de afecciones hereditarias que afecta aproximadamente a 1 de cada 15 000 nacimientos. En la forma más común, llamada deficiencia de 21-hidroxilasa, las mutaciones en el gen CYP21A2 hacen que las glándulas suprarrenales produzcan niveles bajos de cortisol y cantidades excesivas de hormonas andrógenas, como la testosterona. Este fenómeno conduce a una pubertad temprana, a que las niñas tengan rasgos masculinos y a varios problemas de salud, entre otros aspectos.

La terapia de reemplazo de hormonas esteroides es el tratamiento de primera línea, pero en muchas ocasiones puede originar efectos secundarios perjudiciales, lo que pone de manifiesto la necesidad de investigar más profundamente en la enfermedad y poder así establecer los tratamientos más efectivos y seguros.

En el hallazgo, los investigadores, del Hospital Universitario Carl Gustav Carus en Dresden, Alemania, reemplazaron el gen Cyp21a1 en ratones con el gen humano CYP21A2 portador de una mutación. Descubrieron que los ratones genéticamente modificados tenían, a las 20 semanas, glándulas suprarrenales agrandadas mientras expresaban el gen humano mutado. Además, y de manera similar a la enfermedad humana, la mutación provocó que tanto los ratones machos como las hembras tuvieran niveles bajos de corticosterona, la principal hormona del estrés en ratones que es equivalente al cortisol en humanos, y otros desequilibrios hormonales.

Aunque existen modelos animales de hiperplasia suprarrenal congénita, este es el primero en reproducir la condición humana en ratones y capaz de sobrevivir sin ningún tratamiento. «Nuestros modelos imitan con precisión los síntomas observados en pacientes humanos», según Shamini Ramkumar Thirumalasetty, coordinadora de la investigación, quien destaca que, por ejemplo, «los ratones hembra mutantes también tienen problemas de fertilidad, lo que creemos que probablemente se deba a los desequilibrios hormonales provocados por la hiperplasia suprarrenal congénita».

Este modelo de ratón abre una nueva vía que permitirá al equipo estudiar más detalladamente los mecanismos de la enfermedad y encontrar los tratamientos más efectivos.

La investigadora indica que aunque se están desarrollando nuevos tratamientos para minimizar los efectos secundarios de las hormonas esteroides, estos fármacos carecen de modelos ‘in vivo efectivos’ para las pruebas preclínicas. «Nuestro ratón puede servir como un excelente modelo para probar nuevos medicamentos y opciones de tratamiento para pacientes con hiperplasia suprarrenal congénita, como las terapias con células madre, y facilitará la transición de la investigación básica a la clínica».

Mayo 15/2023 (Diario Médico) – Tomado de Endocrinología – Presentado en el XXV Congreso Europeo de Endocrinología  Copyright Junio 2018 Unidad Editorial Revistas, S.L.U. Todos los derechos reservados.

Hace cuatro años un grupo de investigadores encontró a una mujer que podría tener la llave contra la demencia más común en el mundo, el alzhéimer. Aquella huella genética se suma ahora a otra que han hallado en un hombre de 67 años y que servirá como nueva pista con la enfermedad que afecta a más de 38 millones de personas en todo el mundo.

En esta ocasión, la pieza del puzle que porta el hombre está en el gen RELN, H3447R (denominado Reelin-Colbos por el estudio de investigación de biomarcadores de Colombia-Boston), que codifica la proteína de señalización reelina, clave en las principales alteraciones cognitivas y bioquímicas de las demencias relacionadas con la proteína tau. En el caso de la mujer, el misterio se está en una mutación rara en el gen APOE3, uno de los responsables del desarrollo de la neurodegeneración, que actúa como freno frente a la aparición de los síntomas asociados con la enfermedad de Alzheimer. «Hemos caracterizado el segundo caso del mundo en el que hemos comprobado la resiliencia frente la enfermedad de Alzheimer autosómica dominante (ADAD)», explican los autores en Nature.

El equipo de investigación que ha dado con el varón y la nueva mutación es el mismo que encontró a la mujer. El grupo multidisciplinar de la Facultad de Medicina de la Universidad de Harvard, Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf y el Grupo de Neurociencias de la Facultad de Medicina de la Universidad de Antioquia en Medellín (Colombia) llevan décadas resolviendo el rompecabezas de las mutaciones genéticas que causan Alzheimer entre los habitantes emparentados en una región rural de Antioquía y que provocan la aparición de síntomas a edades muy tempranas.

Para poner en contexto ambos casos, Joseph F. Arboleda-Velasquez, uno de los autores y profesor asociado Facultad de Medicina de Harvard, explica a El Mundo que «si en la mujer protegida la mutación estaba en el gen APOE, ahora en el varón la mutación se encuentra en el gen Reelin». Y continúa aportando detalles de las diferencias en cada caso. «En ella, la mutación de APOE se denominó Christchurch, las pruebas mostraban un cerebro que tenía muchas placas de amiloide, pero poca acumulación de tau, otra proteína que también resulta importante para en el alzhéimer. En el hombre se ha observado, además, una elevada presencia de ambas proteínas, tanto amiloide como tau, lo cual indica que es posible estar protegido incluso cuando la patología clínica de alzhéimer es alta».

La ADAD es una forma hereditaria rara de la demencia y que está más comúnmente causada por mutaciones específicas en el gen PSEN1-E280A que codifica la proteína transmembrana presenilina 1. «Se caracteriza por la aparición temprana de deterioro cognitivo, como déficits de memoria, a una edad temprana, típicamente a los 40-50 años de edad», explican los investigadores.

En la publicación se pone en contexto la situación del hombre frente a la de su hermana que sí que desarrolló la sintomatología clínica del alzhéimer y terminó falleciendo a los 73 años, con un cúmulo de patologías asociadas, tras iniciar la demencia a los 61 años. Ambos compartían la mutación PSEN1-E280A con la variante Reelin. Ella también presentó un retraso en la edad de inicio del deterioro cognitivo, aunque con una protección menor en comparación con su hermano y una enfermedad en etapa terminal prolongada. «La hermana tenía antecedentes de una lesión grave en la cabeza, que requirió cirugía reconstructiva, así como antecedentes de depresión e hipotiroidismo. Estos factores pueden haber tenido un impacto en su perfil clínico y deben tenerse en cuenta al evaluar su fenotipo», puntualizan en las conclusiones los autores.

Los investigadores explican que compararon al varón con la mujer, los dos con ADAD tardía. «Ambas personas mostraron una patología amiloide generalizada y considerable en el cerebro, que es un sello patológico de la enfermedad de Alzheimer». Y apuntan las diferencias encontradas: «Sin embargo, hubo una agregación limitada de tau (una proteína estabilizadora de microtúbulos en el cerebro) en la corteza entorrinal, una región del cerebro que se ve afectada característicamente en las primeras etapas clínicas de la enfermedad de Alzheimer».

Para verificar qué sucedía los autores realizaron la secuenciación genética y encontraron que el varón albergaba un tipo diferente de mutación: una nueva variante rara de RELN (H3447R denominada Reelin-COLBOS). Los investigadores detallan los complejos procesos que sirven para explicar la resistencia al desarrollo de las manifestaciones de la neurodegeneración que «esta mutación da como resultado un ligando RELN, una molécula de unión, que puede ser más eficaz para limitar la agregación de tau, pero para lo que se necesita más investigación». Las proteínas APOE y Reelina involucradas en la protección de estos individuos funcionan como ligandos de receptores celulares comunes y los autores apuntan que esto podría sugerir un mecanismo común para la resistencia al Alzheimer.

¿Cómo se podría saber si uno tiene estos genes del alzhéimer? 

Con estos descubrimientos cabe especular si habrá más personas que cumplan estos rasgos y si habría posibilidad de plantear cribado para encontrarlas. «Mientras que sí resulta sencillo realmente llevar a cabo los estudios genéticos para buscar la variante, sin embargo, estamos ante una mutación muy rara. Por lo que lo más seguro es que se encontrará en pocos pacientes», lamenta Arboleda-Velasquez.

Pese a ello, el investigador de Harvard subraya la participación de la comunidad estudiada. «Es importante reconocer la contribución de los pacientes que con mucho sacrificio participan de los estudios clínicos y genéticos. Ellos son los héroes de este descubrimiento».

Una puerta a nuevas terapias contra el alzhéimer 

Si bien en los últimos tiempos llegan buenas noticias en el tratamiento del alzhéimer, la caracterización de estas nuevas pistas genéticas puede suponer opciones a corto plazo. «Cada uno de estos pacientes abre la puerta a varias terapias. Estamos avanzando en el anticuerpo inspirado en el caso de Christchurch y también tenemos progresos en los abordajes inspiradas en el caso de Reelin», detalla Arboleda-Velasquez.

En la actualidad, en EEUU ya está disponible Lecanemab para los pacientes. Se trata de un anticuerpo monoclonal desarrollado por la compañía japonesa Eisai y la estadounidense Biogen indicado para los pacientes que están en las etapas más tempranas de la enfermedad. El fármaco ha logrado reducir la tasa de deterioro cognitivo temprano en un 27% en comparación con un placebo.

Mayo 15/2023 (Diario Médico) – Tomado de Neurología – Estudio en ‘Nature’  Copyright Junio 2018 Unidad Editorial Revistas, S.L.U. Todos los derechos reservados.

Investigadores de la Universidad de Kanazawa informan en Nano Letters de cómo la microscopía de fuerza atómica de alta velocidad permite comprender procesos relacionados con la enfermedad de Alzheimer. Además, la técnica se revela como una herramienta excelente para estudiar el efecto de fármacos contra la enfermedad.

Según la hipótesis amiloide, la enfermedad de Alzheimer -el tipo más común de demencia- está causada por fallos en la producción, acumulación y eliminación de beta-amiloide (Aβ) en el cerebro. Aβ hace referencia a un grupo de péptidos (fragmentos de proteínas) que con el tiempo forman placas en el cerebro de las personas con enfermedad de Alzheimer. Se han desarrollado fármacos para reducir la agregación de Aβ, pero descubrimientos recientes demuestran que los distintos tipos de agregados de Aβ contribuyen de forma diferente al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer. En particular, los agregados intermedios, como las protofibrillas, son más tóxicos que las fibrillas finales propiamente dichas, el principal componente de las placas de Aβ. Por tanto, es necesario comprender con precisión las complejas vías de agregación para seguir desarrollando fármacos eficaces contra la enfermedad de Alzheimer. Kenjiro Ono, de la Universidad de Kanazawa, y sus colegas han logrado ahora visualizar la dinámica estructural de las protofibrillas, así como el efecto de un fármaco desarrollado recientemente a base de anticuerpos anti-Aβ.

Los científicos observaron la formación y la estructura de las protofibrillas de Aβ mediante microscopía de fuerza atómica de alta velocidad (HS-AFM). Este último método se ha revelado en los últimos años como una potente herramienta de nanoimagen para estudiar biomoléculas y su dinámica con alta resolución espaciotemporal. Las observaciones de HS-AFM mostraron que las protofibrillas tienen una estructura nodal, con características estructurales estables -en concreto, el ángulo de unión entre nodos- en varias muestras. Es importante destacar que esta estructura nodal es distinta de las fibrillas maduras propiamente dichas, que tienen una estructura helicoidal.

A continuación, Ono y sus colegas investigaron la disociación de las protofibrillas. Descubrieron que la longitud de las protofibrillas depende de su concentración, lo que sugiere que los agregados pueden disociarse espontáneamente.

Para obtener una visión detallada del funcionamiento de los fármacos anticuerpos anti-Aβ, los investigadores examinaron la unión entre las protofibrillas de Aβ y un nuevo fármaco conocido como lecanemab. Descubrieron que la capacidad de unión (afinidad) de lecanemab por las protofibrillas es casi independiente del tamaño de las protofibrillas; en otras palabras, la afinidad no varía sustancialmente a lo largo del proceso de agregación. Las observaciones de HS-AFM revelaron además que el lecanemab cubre la superficie de pequeños agregados de preprotofibrillas. Al hacerlo, el fármaco inhibe la agregación posterior en protofibrillas, lo que a su vez impide la formación de fibrillas y placas de Aβ propiamente dichas.

Los resultados de Ono y sus colegas aportan pruebas directas de un mecanismo a través del cual un fármaco anticuerpo interfiere en el proceso de agregación de Aβ. En términos más generales, el trabajo confirma la versatilidad del método HS-AFM para estudiar vías bioquímicas. Citas de los científicos: «La HS-AFM de molécula única es una herramienta eficaz para revelar la dinámica estructural de los intermediarios de agregación amiloide transitorios y metaestables y los efectos de los fármacos antiagregantes sobre ellos.»

Mayo 15/2023 (Asia Research News) – Tomado de News Room Copyright 2004 – 2023 Asia Research News

Un nuevo artículo publicado por el destacado especialista australiano en ética de la IA Stefan Harrer PhD propone por primera vez un marco ético completo para el uso, diseño y gobernanza responsables de las aplicaciones de la IA Generativa en la asistencia sanitaria y la medicina.

El estudio, revisado por expertos y publicado en la revista eBioMedicine de The Lancet, detalla cómo los Modelos Lingüísticos Amplios (LLM por sus siglas en inglés) tienen el potencial de transformar fundamentalmente la gestión de la información, la educación y los flujos de trabajo de comunicación en la asistencia sanitaria y la medicina, pero siguen siendo uno de los tipos de IA más peligrosos e incomprendidos.

«Los LLM solían ser aburridos y seguros. Ahora son emocionantes y peligrosas», afirma Harrer, que también es Director de Innovación del Centro de Investigación Cooperativa en Salud Digital (DHCRC), uno de los principales financiadores australianos de la investigación y el desarrollo en salud digital, y miembro de la Coalición por la Inteligencia Artificial en Salud (CHAI).

Los LLM son un componente clave de las aplicaciones de IA generativa para crear nuevos contenidos, como texto, imágenes, audio, código y vídeos, en respuesta a instrucciones textuales. Entre los ejemplos más destacados analizados en el estudio en relación con los principios éticos de diseño, publicación y uso, así como con su rendimiento, figuran el chatbot ChatGPT de OpenAI, el chatbot Med-PALM de Google, el generador de imágenes Stable Diffusion de Stability AI y el bot BioGPT de Microsoft.

El estudio destaca y explica muchas aplicaciones clave para la atención sanitaria:

• ayudar a los clínicos a generar informes médicos o cartas de autorización previa;
• ayudar a los estudiantes de medicina a estudiar de forma más eficiente
• simplificar la jerga médica en la comunicación médico-paciente;
• aumentar la eficiencia del diseño de ensayos clínicos
• ayudar a superar los obstáculos de interoperabilidad y normalización en la extracción de HCE;
• aumentar la eficacia de los procesos de descubrimiento y diseño de fármacos.

Sin embargo, el artículo también destaca que el peligro inherente de la IA generativa impulsada por LLM, derivado de la capacidad de los LLM para producir y difundir de forma autoritaria y convincente contenidos falsos, inapropiados y peligrosos a una escala sin precedentes, se está marginando cada vez más en un bombo publicitario en torno a la última generación de potentes chatbots LLM.

El Dr. Harrer sostiene que las limitaciones de los LLM son sistémicas y tienen su origen en su falta de comprensión del lenguaje.

«La esencia de una recuperación eficaz del conocimiento es formular las preguntas adecuadas, y el arte del pensamiento crítico se basa en la capacidad de sondear las respuestas evaluando su validez con respecto a los modelos del mundo. Los LLM no pueden realizar ninguna de estas tareas. Son intermedios que pueden reducir la inmensidad de todas las respuestas posibles a una pregunta a las más probables, pero son incapaces de evaluar si la pregunta o la respuesta tienen sentido o son contextualmente apropiadas», afirma Harrer.

Por tanto, sugiere que aumentar el tamaño de los datos de entrenamiento y construir LLM cada vez más complejos no mitigará los riesgos, sino que los amplificará. El estudio propone enfoques alternativos para (re)diseñar éticamente las aplicaciones generativas de IA, configurar los marcos normativos y dirigir los esfuerzos de investigación técnica a explorar métodos de aplicación y cumplimiento de los principios éticos de diseño y uso.

El Dr. Añade que, sin supervisión humana, orientación, diseño y funcionamiento responsables, las aplicaciones de IA generativa impulsadas por LLM seguirán siendo una fuente con gran potencial para crear y difundir desinformación o contenidos nocivos e inexactos a una escala sin precedentes.

«El DHCRC desempeña un papel fundamental a la hora de llevar la IA ética a la práctica», ha declarado Annette Schmiede, directora general del DHCRC. «Existe un entusiasmo renovado por el papel de la IA generativa en la transformación de la asistencia sanitaria y nos encontramos en un punto de inflexión en el que la IA empezará a integrarse cada vez más en el ecosistema de la sanidad digital. Estamos en primera línea y marcos como el esbozado en este documento se convertirán en fundamentales para garantizar un uso ético y seguro de la IA.»

«La IA ética requiere un enfoque de ciclo de vida, desde la curación de datos hasta la prueba de modelos y la supervisión continua. Sólo con las directrices y barandillas correctas podemos asegurar que nuestros pacientes se beneficien de las tecnologías emergentes al tiempo que minimizamos los sesgos y las consecuencias no deseadas», dijo John Halamka, M.D., M.S, Presidente de Mayo Clinic Platform y cofundador de CHAI.

«Este estudio proporciona una importante orientación ética y técnica a los usuarios, desarrolladores, proveedores y reguladores de la IA generativa y los incentiva a prepararse de manera responsable y colectiva para el papel transformador que esta tecnología podría desempeñar en la salud y la medicina», dijo Brian Anderson, M.D., Médico Jefe de Salud Digital en MITRE.

Mayo 15/2023 (EurekaAlerts!) – Tomado de News Releases  Copyright 2023 by the American Association for the Advancement of Science (AAAS).

Una proteína que ayuda a los murciélagos a sobrevivir a enfermedades víricas podría servir de lección para desarrollar nuevos tratamientos antiinflamatorios.

Estudiando la inusual capacidad de los murciélagos para albergar virus sin sufrir enfermedades graves, científicos de la Facultad de Medicina Duke-NUS han descubierto una proteína que podría abrir nuevas estrategias para combatir enfermedades inflamatorias en humanos.

«Los murciélagos han sido objeto de gran atención como posibles reservorios del virus SARS-CoV-2 responsable de la pandemia de COVID-19″, afirma el profesor Wang Lin-Fa, del Programa de Enfermedades Infecciosas Emergentes (EID) de Duke-NUS, autor principal del estudio publicado en la revista Cell. «Pero esta capacidad única de albergar y a la vez sobrevivir a infecciones víricas también podría tener un impacto muy positivo en la salud humana si logramos entender y explotar cómo lo consiguen».

La investigación se centra en los complejos multiproteicos llamados inflamasomas, responsables de la inflamación hiperactiva que causa síntomas graves en muchas enfermedades. Los inflamasomas también están implicados en el declive funcional del envejecimiento.

El equipo Duke-NUS descubrió que una proteína murciélago llamada ASC2 tiene una poderosa capacidad para inhibir los inflamasomas, limitando así la inflamación.

«Esto sugiere que la actividad de alto nivel de ASC2 es un mecanismo clave por el que los murciélagos mantienen la inflamación bajo control, con implicaciones para su larga vida y su condición única como reservorio de virus», explicó la Dra. Matae Ahn, primera autora y coautora del estudio, que es investigadora adjunta del Programa EID y del Programa Clínico Académico de Medicina SingHealth Duke-NUS. El Dr. Ahn también es clínico a tiempo completo en el Programa de Residencia de Postgrado Año Uno (PGY1) de SingHealth después de graduarse en Duke-NUS en 2022.

Vivian Chen, coautora del estudio y candidata al doctorado en Duke-NUS, destacó que el equipo había podido demostrar el potencial de explotación de la proteína del murciélago en humanos al demostrar que también podía ser eficaz en ratones*. Explicó: «La expresión de la proteína murciélago en ratones modificados genéticamente amortiguó la inflamación y redujo la gravedad de las enfermedades provocadas por diversos desencadenantes, incluidos los virus».

El examen detallado de la proteína ASC2 identificó cuatro aminoácidos en la molécula que eran clave para que la proteína de murciélago fuera más eficaz para amortiguar la inflamación que su correspondiente proteína humana. Esto aporta información valiosa para el desarrollo de fármacos que puedan imitar el efecto antiinflamatorio de la proteína del murciélago.

El siguiente paso del equipo es investigar el potencial de sus hallazgos para el tratamiento humano. El profesor Wang afirmó: «Hemos solicitado patentes basadas en este trabajo y estamos explorando asociaciones comerciales para el descubrimiento de fármacos. Esperamos desarrollar una nueva clase de fármacos antiinflamatorios para enfermedades humanas causadas por el inflamasoma».

El profesor Wang cree firmemente que es hora de centrarse en los aspectos más prometedores de lo que hace especiales a los murciélagos «para ayudar a combatir las enfermedades humanas del futuro».

El Vicedecano Principal de Investigación de Duke-NUS, el profesor Patrick Casey, comentó sobre el estudio: «Incluso cuando la COVID-19 empieza a alejarse de la atención del público, el profesor Wang y su equipo siguen abriendo nuevos caminos con su investigación básica sobre la biología de los murciélagos, aportando conocimientos únicos que potencialmente pueden reforzar la preparación mundial frente a pandemias. Este es un excelente ejemplo del inmenso valor que la investigación científica básica aporta a la resolución de los grandes retos de la salud pública.»

Mayo 12/2023 (AsiaResearchNews) – Tomado de NewsRoom  Copyright 2004 – 2023 Asia Research News.

Según un estudio presentado en el 25º Congreso Europeo de Endocrinología, celebrado en Estambul, unos niveles elevados de cortisol, la hormona del estrés, durante el tercer trimestre del embarazo pueden mejorar el habla y el lenguaje en los tres primeros años de vida del niño. Los resultados ayudan a los investigadores a comprender mejor el papel del cortisol en el desarrollo tanto fetal como infantil.

El desarrollo del lenguaje durante la primera infancia puede indicar lo bien que se desarrolló el sistema nervioso del bebé en el útero. La exposición prenatal al cortisol -una hormona esteroidea que ayuda al organismo a responder al estrés- dirige el crecimiento del feto y también afecta a su desarrollo cerebral. Sin embargo, aún se desconocen los efectos del cortisol en el desarrollo temprano del lenguaje.

En este estudio, investigadores del Hospital Universitario de Odense analizaron datos sobre los niveles de cortisol de 1.093 mujeres danesas durante su tercer trimestre de embarazo y sobre las habilidades del habla y el lenguaje de 1.093 niños daneses de entre 12 y 37 meses, procedentes de la Cohorte Infantil de Odense. Descubrieron que los niños expuestos a altos niveles de cortisol en el útero podían decir más palabras entre los 12 y los 37 meses, mientras que las niñas comprendían mejor más palabras entre los 12 y los 21 meses.

«Que sepamos, éste es el primer estudio que investiga la relación entre los niveles de cortisol materno y el desarrollo del lenguaje en los niños a lo largo del tiempo, teniendo en cuenta también el sexo del niño y el nivel educativo de la madre», afirma la Dra. Anja Fenger Dreyer, que participó en el estudio.

Y añade: «Hemos tenido acceso a una gran cohorte de estudio, métodos de análisis de alta calidad y covariables relevantes, lo que convierte nuestro estudio en una importante contribución a la comprensión fisiológica de la exposición prenatal al cortisol en la maduración fetal y el desarrollo infantil.»

El equipo evaluará a continuación si los niños expuestos a un cortisol elevado en el útero tienen más probabilidades de presentar puntuaciones más altas en el cociente intelectual (CI). Además de los datos sobre los niveles de cortisol materno y el desarrollo temprano del lenguaje, la cohorte infantil de Odense también dispone de datos sobre pruebas de inteligencia realizadas a niños de 7 años. «Se sabe que el desarrollo temprano del lenguaje en los niños predice la función cognitiva en etapas posteriores de la vida, como la atención, la memoria y el aprendizaje, por lo que queremos investigar si la exposición prenatal al cortisol también está asociada a las puntuaciones de CI de los niños de 7 años», afirma la Dra. Fenger Dreyer.

Mayo 13/2023 (EurekaAlert!) – Tomado de News Releases – Reports and Proceedings EUROPEAN SOCIETY OF ENDOCRINOLOGY  Copyright 2023 by the American Association for the Advancement of Science (AAAS).