Los primeros autores de esta investigación internacional publicada en la revista Science Advances son los expertos Juan Alberto Ortega Cano, de la Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud y el Instituto de Neurociencias (UBneuro) de la UB, e Ivan Sasselli, del Centro de Física de Materiales (CSIC-UPV/EHU). También han participado investigadores de la Universidad de Zaragoza y la Northwestern University (Estados Unidos), entre otros.

Una de las causas genéticas más frecuentes de la ELA es la mutación en el gen C9orf72, ya que se encuentra en aproximadamente el 33 % de los pacientes afectados por la ELA familiar y el 5 % de los afectados por la ELA esporádica en España. En estos pacientes se generan unos dipéptidos con gran cantidad de cargas positivas que generan efectos altamente tóxicos en las neuronas motoras. En la primera parte del estudio, los investigadores combinaron técnicas computacionales y experimentales para mejorar la comprensión molecular de estos dipéptidos y cómo producen este proceso patológico.

Una unión tóxica para las neuronas

Los resultados mostraron que la toxicidad de estos compuestos se debe en parte a los que se unen al ARN ribosomal (ARNr), una molécula que participa en el proceso de traducción de la información genética y la síntesis de proteínas en la célula. «Hemos visto que estos dipéptidos, especialmente los ricos en el aminoácido arginina (poli-glicina-arginina o poly-GR), se unen a una región concreta del ARNr afectando a la biosíntesis de ribosomas (pequeñas estructuras que se encargan de sintetizar las proteínas de nuestro organismo) y la traducción de proteínas en neuronas motoras humanas, produciendo la muerte de estas», explica el profesor Juan Alberto Ortega Cano. «Además —añade el investigador— esta interacción de los poly-GR con el ARNr es mucho más fuerte que la interacción del poly-GR con otras proteínas ribosomales que se habían descrito previamente en otros estudios, y explica por qué estos dipéptidos tienen gran afinidad en unirse a los ribosomas de las células».

Ante estos resultados, los investigadores diseñaron una estrategia innovadora para engañar a los dipéptidos poly-GR y reducir su toxicidad. Crearon una trampa, una molécula que imitaba la secuencia específica del ARNr con la que se unen los poly-GR durante el proceso patológico, con el objetivo de evitar así los efectos neurotóxicos de esta unión. La aplicación de esta estrategia en neuronas derivadas de tejido de pacientes in vitro y en modelos de la enfermedad (moscas del vinagre) in vivo muestran que «reduce los defectos en la biosíntesis de ribosomas en la traducción de proteínas y la toxicidad en células que expresan poly-GR, así como la muerte en motoneuronas de pacientes de ELA con mutaciones en el gen C9orf72,», detalla el investigador.

Aunque todavía queda mucha investigación por validar y comprender completamente el funcionamiento de esta estrategia, los investigadores señalan en el artículo que estos resultados, prometedores, refuerzan la idea de que el uso de trampas de ARN es útil «no solamente para estudiar las interacciones ARN-proteína, sino también para proteger a las neuronas de los efectos perjudiciales de proteínas anómalas que se generan en otras enfermedades neurodegenerativas».

Referencia

Ortega JA, Sasselli IR, Boccitto M, Fleming AC, Forturna TR, Li Y, et al. CLIP-Seq analysis enables the design of protective ribosomal RNA bait oligonucleotides against C9ORF72 ALS/FTD poly-GR pathophysiology. Sci Adv[Internet]. 2023[citado 15 nov 2023]; 10;9(45):eadf7997. doi: 10.1126/sciadv.adf7997. Epub 2023 Nov 10.

17 noviembre 2023 | Fuente: EurekAlert| Tomado de Comunicado de Prensa

Un hombre tetrapléjico en Suiza se convirtió en la primera persona en probar una tecnología que combina dos implantes, uno cerebral y otro en la médula espinal, que le permiten volver a mover los brazos, las manos y los dedos a través del pensamiento.

La combinación de estos implantes ya permitió a un parapléjico volver a caminar mediante el pensamiento; un avance que fue publicado en la revista científica Nature en mayo. Ahora es la primera vez que se utiliza esta doble técnica para las extremidades superiores.

«La movilidad del brazo es más compleja», explicó a la AFP la cirujana Jocelyne Bloch, quien realizó las intervenciones quirúrgicas para colocar los implantes. Con los brazos no se plantea el problema del equilibrio pero «la musculatura de la mano es bastante fina, con muchos músculos pequeños diferentes que se activan al mismo tiempo para determinados movimientos», explica.

El paciente, que ha pedido permanecer en el anonimato, es un suizo de 46 años que perdió el uso de sus brazos tras una caída. El mes pasado se sometió a dos operaciones en el Centro Hospitalario Universitario Vaudois (CHUV) en Lausana, Suiza.

Uso de doble implante en fase de entrenamiento

La primera fue para colocarle, en lugar de un pequeño trozo de hueso craneal, un implante cerebral de unos pocos centímetros de diámetro concebido por la organización francesa CEA-Clinatech. En la segunda operación le colocaron electrodos desarrollados por la empresa nederlandesa Onward a la altura de la médula cervical, conectados a una pequeña caja implantada en el abdomen.

El implante cerebral registra las regiones del cerebro que se activan cuando el paciente piensa en un movimiento y las comunica a los electrodos. Algo así como un «puente digital». «Por el momento todo va bien», describió Jocelyne Bloch, cofundadora de Onward y que sigue siendo consultora de la empresa.

«Podemos registrar la actividad cerebral y sabemos que la estimulación funciona. (…) Pero es demasiado pronto para hablar de los progresos que ha realizado, de lo que es capaz de hacer ahora».

El paciente se encuentra en la fase de entrenamiento, para intentar conseguir que el implante cerebral reconozca los distintos movimientos que ha dejado de hacer. Habrá que repetir muchas veces estos movimientos antes de que se vuelvan naturales.

El proceso durará «meses», según Bloch. Está previsto que otros dos pacientes participen en este ensayo cuyos resultados se publicarán más adelante. La estimulación de la médula espinal ya se ha utilizado en el pasado para que pacientes paralíticos puedan mover sus brazos, pero por separado, sin un implante cerebral acoplado.

Referencia

Lorach H, Galvez A, Spagnolo V, Martel F, Karakas S, Intering N, et al. Walking naturally after spinal cord injury using a brain–spine interface. Nature [Internet].2023[citado 3 oct 2023]; 618, 126–133. https://doi.org/10.1038/s41586-023-06094-5

3 octubre 2023| Fuente: DW.com|Tomado de | Ciencia

Grégoire Courtine, un reputado neurocientífico suizo de la Escuela Politécnica Federal de Lausana (EPFL), lleva años investigando cómo hacer que personas con la médula espinal dañada vuelvan a andar. Sus avances los demostró con ratas, en 2012, con monos, en 2016, y con humanos en 2018 y en 2022, cuando él y su equipo lograron que tres pacientes con parálisis vuelven a caminar con implantes eléctricos en la médula espinal.

Ahora, en un estudio publicado en  Nature, Courtine y su grupo del centro NeuroRestore, de la EPFL han identificado el tipo de neurona que se activa y remodela con la estimulación de la médula espinal, lo que permite a los pacientes ponerse de pie, caminar y reconstruir sus músculos.

En los trabajos de investigación previos, realizados en colaboración con la neurocirujana Jocelyne Bloch, lograron que nueve pacientes paralizados por una lesión de la médula espinal pudieran volver a caminar —con ayuda de andadores y muletas—, tras introducirles implantes de estimulación eléctrica.

Estos voluntarios “se sometieron a una estimulación eléctrica epidural selectiva de la zona que controla el movimiento de las piernas pudieron y pudieron recuperar parte de la función motora”, especifican los autores.

En el nuevo estudio “hemos demostrado no solo la eficacia de esta terapia en los nueve pacientes, sino también que la mejora de la función motora se mantenía una vez finalizado el proceso de neurorrehabilitación y cuando se apagaba la estimulación eléctrica. Esto sugería que las fibras nerviosas utilizadas para caminar se habían reorganizado”, señala Courtine.

Los autores pensaron que resultaba crucial comprender exactamente cómo se produce esta reorganización neuronal para desarrollar tratamientos más eficaces y mejorar la vida del mayor número posible de personas.

Una propiedad sorprendente de una familia de neuronas

Para ahondar en esta comprensión, el equipo estudió primero los mecanismos subyacentes en ratones. Esto reveló una propiedad sorprendente en una familia de neuronas que expresan el gen Vsx2: mientras que estas neuronas no son necesarias para caminar en ratones sanos, eran esenciales para la recuperación de la función motora tras una lesión medular.

Este descubrimiento fue la culminación de varias fases de investigación fundamental. Por primera vez, los científicos pudieron visualizar la actividad de la médula espinal de un paciente mientras caminaba. Esto condujo a un hallazgo inesperado: durante el proceso de estimulación de la médula espinal, la actividad neuronal disminuyó durante la marcha. Los autores plantearon la hipótesis de que esto se debía a que la actividad neuronal se dirigía selectivamente a la recuperación de la función motora.

El trabajo revela una propiedad en un grupo de neuronas que expresan el gen Vsx2: no son necesarias para caminar en ratones sanos, pero sí esenciales para la recuperación de la función motora tras una lesión medular

Para probar su hipótesis, el equipo desarrolló una tecnología molecular avanzada. “Hemos establecido la primera cartografía molecular en 3D de la médula de la médula espinal”, destaca Courtine. “Nuestro modelo nos permitió observar el proceso de recuperación con mayor detalle, a nivel neuronal”, señala.

Gracias a este modelo de gran precisión, el equipo descubrió que la estimulación de la médula espinal activa las neuronas Vsx2 y que estas neuronas adquieren una importancia creciente a medida que se desarrolla el proceso de reorganización.

Un implante espinal versátil

Stéphanie Lacour, profesora de la EPFL, ayudó al equipo de Courtine y Bloch a validar sus hallazgos con los implantes epidurales desarrollados en su laboratorio. Lacour adaptó los dispositivos de estimulación eléctrica añadiendo diodos emisores de luz que permitían al sistema no solo estimular la médula espinal, sino también desactivar las neuronas Vsx2 por sí solas mediante un proceso optogenético.

Cuando se utilizó el sistema en ratones con una lesión en la médula espinal, estos dejaron de caminar inmediatamente como resultado de la desactivación de las neuronas, pero no hubo ningún efecto en los ratones sanos. Esto implica que las neuronas Vsx2 son necesarias y suficientes para que las terapias de estimulación de la médula espinal sean eficaces y conduzcan a la reorganización neuronal.

El estudio demuestra que las neuronas Vsx2 son necesarias y suficientes para que las terapias de estimulación de la médula espinal sean eficaces y conduzcan a la reorganización neuronal

“Es esencial para los neurocientíficos poder comprender el papel específico que desempeña cada subpoblación neuronal en una actividad compleja como la marcha”, subraya Bloch. “El nuevo estudio, en el que nueve pacientes de ensayos clínicos pudieron recuperar cierto grado de función motora gracias a nuestros implantes, nos da una valiosa visión del proceso de reorganización de las neuronas de la médula espinal”.

Jordan Squair, que se dedica a las terapias regenerativas dentro de Neurorestore, añade: “Esto allana el camino hacia tratamientos más específicos para los pacientes paralizados. Ahora podemos aspirar a manipular estas neuronas para regenerar la médula espinal”.

enero 30/2023 (SINC)

Referencia:

Courtine G., Bloch  J. et al. “The neurons that restore walking after paralysis”. Nature (2022).

Investigadores de la Universidad de Northwestern (Illinois, Estados Unidos) han desarrollado una terapia inyectable que utiliza moléculas sintéticas ‘danzantes’ para revertir la parálisis y reparar el tejido tras graves lesiones medulares en ratones. Los resultados del estudio experimental se presentan en  de la revista Science.

Samuel I. Stupp, líder del trabajo que publicado en  Science , explica que las moléculas empleadas “son péptidos sintéticos que incluyen una señal biológica que puede activar la reparación y regeneración de los tejidos dañados”. El equipo administró una única inyección en los tejidos que rodean la médula espinal de roedores paralizados y, cuatro semanas después, los animales pudieron volver a caminar.

Las moléculas utilizadas son péptidos sintéticos que incluyen una señal biológica para activar la reparación y regeneración de los tejidos dañados en la médula espinal.

La terapia desarrollada por Stupp y su equipo “consiste en [inyectar] filamentos a nanoescala que contienen cientos de miles de péptidos sintéticos unidos entre sí. Esta arquitectura imita la matriz natural que rodea a las células de la médula espinal y de otros tejidos”.

El investigador agrega: “Los filamentos se disuelven primero en agua cuando se inyectan, pero en cuanto entran en contacto con los tejidos vivos de la médula, el líquido se gelifica formando una matriz que se asemeja a la matriz natural que rodea a todas las células”.

El descubrimiento clave fue que “cuando se mueven las moléculas que forman los filamentos portadores de las señales de regeneración y reparación, estas son mucho más efectivas. Esto no se sabía antes, de ahí el avance que supone nuestra terapia”, subraya Stupp.

Movimiento constante de las moléculas

Este experto en medicina regenerativa explica que “los receptores de las neuronas y otras células se mueven constantemente. Por ello, la innovación ha consistido en controlar el movimiento colectivo de más de 100.000 moléculas dentro de las nanofibras. Haciendo que se muevan, ‘bailen’ o incluso salten temporalmente fuera de estas estructuras, conocidas como polímeros supramoleculares, para conectarse más eficazmente con los receptores”

La innovación clave ha consistido en controlar el movimiento colectivo de cientos de miles de moléculas dentro de las nanofibras. Haciendo que se muevan, ‘bailen’ o incluso salten para conectarse más eficazmente con los receptores.

Los daños medulares ocasionados por accidentes de tráfico, explosiones, disparos o lesiones deportivas suelen ser irreversibles. Sin embargo, dice Stupp, “nuestra terapia envía señales a las neuronas de la médula espinal dañadas o seccionadas que les ordenan regenerarse, construir nuevos vasos sanguíneos y formar mielina, una sustancia que rodea a las neuronas para enviar señales eléctricas entre el cerebro y el resto del cuerpo en ambas direcciones y que nos permiten sentir y movernos”.

Además, destaca que este tratamiento “también reduce la formación de cicatrices que impiden la regeneración de las neuronas dañadas, al volver a hacer crecer los axones cortados —los cables eléctricos que transmiten las señales— y ayuda a salvar las neuronas motoras, que son las que nos permiten movernos”.

Una vez que la terapia cumple su función, los materiales inyectados se biodegradan en nutrientes para las células en un plazo de 12 semanas y luego desaparecen completamente del organismo sin efectos secundarios apreciables.

El tratamiento experimental envía señales a las neuronas de la médula espinal dañadas o seccionadas que les ordenan regenerarse, construir nuevos vasos sanguíneos y formar mielina

«El objetivo de nuestra investigación es encontrar una solución que evite que las personas queden paralizadas tras un traumatismo o una enfermedad”, apunta Stupp. “Este sigue siendo un gran reto porque el sistema nervioso central, que incluye el cerebro y la médula espinal, no tiene una capacidad para repararse a sí mismo después de una lesión o tras la aparición de una enfermedad degenerativa”.

Solicitud a la FDA para ensayos en humanos

El líder del trabajo comenta a SINC que en 2022 tienen previsto dirigirse a la Administración de Alimentos y Medicamentos de Estados Unidos (FDA) para que les indique los requisitos necesarios que permitan “iniciar los ensayos en pacientes humanos”.

En el estudio figura como primera firmante la investigadora española Zaida Álvarez Pinto, que ha regresado al Instituto de Bioingeniería de Cataluña, tras siete años en la Universidad de Northwestern.

Según Stupp, el concepto desarrollado en su estudio podría servir también para futuras terapias de otras enfermedades. “Los tejidos del sistema nervioso central que hemos regenerado con éxito en la médula espinal lesionada [de ratones] son similares a los del cerebro afectado por accidentes cerebrovasculares y enfermedades neurodegenerativas, como el párkinson y el alzhéimer”, concluye.

enero 22/2022 (SINC)

Referencia:

Stupp S.I.  et al. “Bioactive Scaffolds with Enhanced Supramolecular Motion Promote Recovery from Spinal Cord Injury”. Science, noviembre 2021.

Después de una lesión de médula espinal, el trasplante de células olfativas ensheathing (OECO) en el sitio del daño mejora significativamente el rendimiento del aparato locomotor, según un análisis sistemático de la literatura, publicado esta semana en Plos Biology

Para llegar a esta conclusión, Ralf Watzlawick, Jan Schwab, y sus colegas del Centro Médico Wexner de la Universidad del Estado de Ohio, en Estados Unidos; la Charité Universtaetsmedizin, en Berlín, Alemania, y el consorcio CAMARADES (Collaborative Approach to Meta Analysis and Review of Animal Data from Experimental Studies), analizaron 49 estudios, publicado entre 1949 y 2014, que incluían 62 experimentos con 1 164 animales.

Las lesiones de la médula espinal se deben principalmente a un trauma, a menudo producido en accidentes de tráfico o deportivos, habitualmente con consecuencias devastadoras e irreversibles. Actualmente, se intenta restaurar la función mediante el trasplante de células olfativas ensheathing (OECO) en la zona dañada. No obstante, aún se desconoce si estos trasplantes pueden funcionar y, en tal caso, cómo optimizarlos.

Las OECO han demostrado ser neuroprotectores y promover la neurorregeneración en diferentes entornos, si bien los estudios al respecto han sido contradictorios. Por lo tanto, para examinar la evidencia in vivo de la eficacia de este procedimiento, los autores llevaron a cabo un metanálisis para, de ese modo, explorar la influencia de las variaciones en los enfoques experimentales y los datos no reportados.

Los datos analizados por los autores justifican el uso de las OECO como sustrato celular para desarrollar y optimizar protocolos mínimamente invasivos y seguros para reparar la médula espinal dañada. También identificaron varios aspectos del procedimiento de trasplante de células que podrían tener un impacto significativo en el tamaño del efecto terapéutico, como el tiempo de aplicación, el uso de la cirugía de micro-disección para «refrescar» el tejido de la cicatriz, la localización de las células trasplantadas, el número de inyecciones, el volumen inyectado y la dosis de las células administradas.

junio 06/ 2016 (ediciones médicas)

Esta investigación, que podría conducir al desarrollo de nuevos tipos de medicamentos para tratar la esclerosis múltiple, fue dirigida por investigadores de la Universidad de Toronto, Canadá.

La EM es una enfermedad neurológica progresiva, que se diagnostica con mayor frecuencia entre los adultos jóvenes de entre 15 y 40 años. Si bien se desconoce la causa exacta de la EM, la respuesta inmune del organismo está involucrada, y es el destino de todos los medicamentos actuales utilizados en el tratamiento. Estos medicamentos no curan la enfermedad, pero sí ayudan a aliviar los síntomas y retrasar la progresión de la dolencia.

El foco de la investigación del equipo de investigadores fue un cambio en la médula espinal que involucró a una proteína, que se une a un receptor celular específico para el neurotransmisor glutamato. Este complejo de proteína del receptor ligado estuvo presente en niveles más altos en los tejidos de la médula espinal de los pacientes con EM fallecidos y en modelos animales para la EM.

La posibilidad de un nuevo tratamiento de la EM se basa en lo que el equipo de investigadores fue capaz de demostrar después de este descubrimiento. Usando técnicas desarrolladas en su laboratorio, los investigadores crearon un nuevo péptido, un pequeño fragmento de proteína, para tratar de interrumpir este cambio en los modelos animales de esclerosis múltiple.
marzo 4/2015 (Diario Médico)

Más información:

Optimizing multiple sclerosis diagnosis: gene expression and genomic association

Comparative efficacy of switching to natalizumab in active multiple sclerosis

Bradley T. Lang, Jared M. Cregg,Marc A. DePaul, Amanda P. Tran,Kui Xu.Modulation of the proteoglycan receptor PTPσ promotes recovery after spinal cord injury.Nature. 03 Dec 2014

En su nuevo estudio,publicado en Nature Chemical Biology (doi:10.1038/nchembio.767), los científicos han hallado que la DMS está producida en niveles anormalmente altos en las médulas espinales de ratas con dolor neuropático y parece causar dolor cuando es inyectada. Los hallazgos sugieren que inhibir esta molécula podría ser una diana fructífera para el desarrollo de fármacos.

La DMS parece provocar dolor en parte por la estimulación de la liberación de moléculas proinflamatorias procedentes de los astrocitos.

Los autores del trabajo, coordinados por Gary Siuzdak, profesor de Química y Biología Molecular del citado centro, comenzaron su investigación con un modelo estándar de dolor neuropático en ratas de laboratorio. Con la colaboración de Gary J. Patti, que ahora es profesor de Genética y Química de la  Universidad de Washington, en Saint. Louis, recogieron muestras de un nervio de la tibia previamente dañado y producía dolor neuropático. También recolectaron plasma sanguíneo de ratas y tejido de sus médulas espinales.

Tras este paso, los científicos determinaron los niveles de metabolitos en estos tejidos y los compararon con los niveles de los animales control. De forma inesperada, hallaron que casi todas las alteraciones principales en los niveles de metabolitos no estaban presentes en las fibras nerviosas de la pierna dañada, ni en el plasma sanguíneo, sino en los tejidos de la llamada «asta dorsal», región de la médula espinal que normalmente recibe señales del nervio periférico (tibial) y las transmite al cerebro.

«Después de que el nervio esté dañado, se degrada y se reconstruye en el sitio de la lesión, pero la remodelación también se produce, posiblemente durante un periodo más largo, en el extremo del nervio donde se conecta con las neuronas del asta dorsal (asta posterior de la médula dorsal)», ha dicho Patti. A continuación, realizaron un test para ver qué metabolitos estaban alterados en los tejidos del asta dorsal y que podrían evocar signos de señalización de dolor en cultivos tisulares de médula espinal de ratas. Así dieron con la DMS.

El equipo de Siuzdak y Patti está ahora intentando conocer más sobre los mecanismos por los que la DMS induce el dolor. Además, están analizando los inhibidores de la producción de DMS que podrían probar tratamientos eficaces o preventivos para el dolor neuropático
Enero 23/2012 (Diario Médico)

Gary J. Patti, Oscar Yanes, Leah P Shriver, Jean-Phillipe Courade, Ralf Tautenhahn, Gary Siuzdak.Metabolomics implicates altered sphingolipids in chronic pain of neuropathic origin. Publicado en Nature Chemical Biology. 22 Enero 2012

El científico canadiense Michael Fehlings presentó por primera vez el ensayo, basado en el uso de la proteína B-210, creada en la Universidad de Montreal para la farmacéutica Bioaxone y comercializada como Cethrin, en el Global Spine Congress, celebrado en Barcelona.

El estudio, desarrollado en ocho centros de investigación de Estados Unidos y Canadá, muestra resultados realmente esperanzadores para cambiar radicalmente la terapia para personas que quedan tetrapléjicas a raíz de accidentes automovilísticos o lesiones deportivas, explicó el Dr. Fehlings.

Fehlings, especialista en parálisis, explicó que el fármaco utilizado en el ensayo, cuyos resultados se publicarán en los próximos meses en el Journal of Neurotrauma (doi:10.1089/neu.2011.1765), posee una proteína fabricada mediante tecnología de recombinación de ADN. Se trata de una proteína que bloquea una molécula llamada Rho e impide que las células de la médula espinal, destrozadas o seriamente lesionadas en algún traumatismo, puedan regenerarse.

En el experimento, se utilizó una única dosis del fármaco que se inyectó durante una cirugía de regeneración de la médula espinal y se siguió la evolución de cada paciente durante un año. El estudio se realizó entre el 2005 y el 2007.

A modo de ejemplo, el coordinador del ensayo clínico mostró el video de un paciente con parálisis severa que no podía mover brazos y manos y tampoco podía sostenerse a sí mismo en alguna postura. “Después de un año, tenía recuperado el uso de sus manos, podía moverse en una silla y había empezado a caminar con la ayuda de una estructura”.

En las afectaciones torácicas hubo un nivel bajo de regeneración, explicó. Sin embargo, en las cervicales se vieron niveles de mejora bastante significativos.

El ensayo verificó la seguridad y viabilidad de la terapia y el próximo paso será el estudio aleatorio con grupo de control y un protocolo riguroso doble ciego.

“Ya hemos visto que el fármaco es seguro y viable y esto es muy esperanzador porque es la primera vez que un agente recombinante es usado para potenciar el crecimiento de las fibras nerviosas. Ahora tenemos que constatar que realmente funcione para un gran número de pacientes”, concluyó el investigador.
marzo 30/2011 (JANO)

Para los lectores del dominio *sld.cu, tiene acceso al texto completo de este artículo a través de Hinari. Journal of Neurotrauma. A phase I/IIa clinical trial of a recombinant Rho protein antagonist in acute spinal cord injury. Versión preliminar en línea marzo 8/2011.